-Dedicado a mis padres incondicionales y a mi abuelo Vicente, mi mentor y ejemplo de vida… Índice Agradecimientos Resumen Abstract Introducción General Objetivos Capítulo 1: Taxonomía de Anisakidae Introducción Áreas de muestreo Los hospedadores Los parásitos: Nematoda, Ascaridida, Anisakidae Taxonomía Checklist del género Contracaecum Antecedentes de investigación en Anisakidae Materiales y Métodos Toma de muestras y procesamiento de los hospedadores Prospección de los nematodos Resultados Contracaecum pelagicum Johnston & Mawson, 1942 Redescripción Resumen taxonómico Comentarios Contracaecum pelagicum: Larva de cuarto estadio (L4) Resumen taxonómico Comentarios Contracaecum chubutensis Garbin, Díaz, Cremonte & Navone, 2008 Descripción Resumen taxonómico Comentarios Contracaecum sp.: Larva de cuarto estadio (L4) Resumen taxonómico I III VII 1 4 6 6 6 11 14 15 16 24 26 26 27 31 32 32 33 34 42 42 42 45 45 46 46 52 52 Comentarios Contracaecum bioccai Mattiucci, Paoletti, Olivero, Baldiris, Arroyo, Garbin, Navone, Nascetti, 2008 Descripción Resumen taxonómico Comentarios Contracaecum n. sp.1 Descripción Resumen taxonómico Comentarios Contracaecum mirounga Nikolskiy, 1974 Redescripción Resumen taxonómico Comentarios Contracaecum sp. 2 Descripción Resumen taxonómico Comentarios Capítulo 2: Caracterización molecular de Anisakidae Introducción Antecedentes Materiales y Métodos Especímenes analizados Extracción del ADN Amplificación y secuenciación del ADN Análisis de secuencias Electroforesis de alozimas multiloculares Resultados Análisis de ADN mitocondrial cox2 Análisis de alozimas multiloculares Discusión Capítulo 3: Desarrollo larvario, biología de la transmisión y asociación parasitaria en Anisakidae Introducción Antecedentes Materiales y Métodos Resultados 52 56 56 57 57 60 60 61 61 70 70 71 71 76 76 77 77 82 82 83 84 84 85 86 86 87 89 89 90 103 106 106 109 111 114 Contracaecum pelagicum Johnston & Mawson, 1942 Larva de tercer estadio (L3) Diversidad y reclutamiento de larvas de Anisakidae Pruebas de biología molecular Estado de desarrollo y distribución de Anisakidae en el tracto digestivo de Spheniscus magellanicus Estudios de Asociación Parasitaria Evaluación de la regurgitación como mecanismo de depuración de nematodos Discusión Capítulo 4: Especificidad hospedatoria en Anisakidae Introducción Materiales y Métodos Resultados Discusión Discusión y Perspectivas Conclusiones Referencias bibliográficas 115 115 119 119 121 125 126 130 137 137 140 144 153 156 160 164 Agradecimientos *Quiero agradecer, ante todo, a mis padres, por su constante apoyo a ese hijo soñador que voló primero, quizás, estando lejos de casa para cumplir sus metas. Este es el fruto del esfuerzo y el sacrificio de ustedes también… *A mi abuelo Vicente, mi gran maestro, consejero y guía, nadie como vos para cuestionarse aspectos de la ciencia y la naturaleza. Tenías la visión de un científico nato, pero bueno, por esas cosas de la vida te tocó trabajar el campo. Sin embargo abuelo, ya ves, tu nieto sigue los pasos de tu influencia. Allá en el cielo, donde estés, muchas gracias abuelo querido… *A mis hermanos Marina y Lisandro, quienes siempre están presentes de cualquier forma, preguntando, dándome aliento, cuidándome. El diseño de tapa quedó divino Maio, sos una maestra diseñadora. Gracias a ambos… *A mi sobrina Valentina, lo más precioso que tengo y una divina razón de vivir, gracias Tinotera hermosa… *Quiero agradecer especialmente a mi directora de tesis, Dra. Graciela T. Navone, por haberme brindado la posibilidad de realizar mi tesis doctoral bajo su supervisión. Corría el año 2004 y antes de comenzar el doctorado me encontraba en España, terminando mi tesis de maestría. En aquel momento sentía un profundo sentimiento por volver y trabajar en el país, y fue Graciela quién me dio la posibilidad de hacerlo. Le agradezco la experiencia transmitida, la dedicación para conmigo y el esfuerzo para que se pudieran cumplir los objetivos de mi plan de trabajo, además del pensamiento crítico con el que me hizo cuestionar e influenciar mi curiosidad por los nematodos Anisakidae, parásitos de aves marinas. Gracias Gra, de todo corazón… *A mi codirectora, Dra. Florencia Cremonte, su codirección y consejo en temas puntuales con respecto a la tesis, como el ofrecimiento de su laboratorio en el CENPAT para realizar la prospección y observación del material. *A Anita Huespe, ex compañera de Facultad en Córdoba y amiga, quién se brindó de forma incondicional dándome hospedaje en Puerto Madryn durante las campañas. Gracias negrita, de corazón… *A Natalia Ponce, por su incansable oído en mis días grises, gracias por escucharme, ser mi sustento y tranquilizarme en los momentos críticos de mi vida… I *Al cuasi licenciado Gastón Berriex, por ayudarme en parte con las prospecciones de los pingüinos. Gracias Tongas, fue muy útil tu ayuda… *A mi compañera de trabajo, Dra. Julia Diaz, no solo compañera sino también una buena consejera, ayudándome con su visión objetiva siempre que fuera necesario. Tus consejos sirvieron de mucho, gracias Jules… *A Sonia Laurenti, “la tía Sonia”, por su entera disposición hacia mi, siempre tratando de asistirme ante alguna necesidad que pudiera surgir con respecto a las campañas y a la prospección de material en el CENPAT de Puerto Madryn. A Héctor Galelli también, por su desinteresada ayuda y disposición Gracias tía, de todo corazón… *A mi compañera, Dra. Juliana Notarnicola, por su revisión final de la tesis y su mirada atenta ante los pequeños detalles que a mi ojo pasarían desapercibidos. Gracias Juli… *A mi compañera, Dra. Rosario Robles, por su ayuda en el Capítulo 4, sus consejos y visión con respecto al tema. *A mi compañera Cecilia Carballo, por ayudarme en Capitulo 3, con su visión crítica y particular sobre el tema. *A mi compañero, Dr. Pablo Riccillo, por la revisión del Capítulo 2 con respecto a cuestiones puntuales de biología molecular. *A todos mis compañeros de trabajo que no he nombrado: Inés, Laurita, Chechu, Maru, Lorena, Marcela, Mariela y Cailo, que sin duda, en algún momento he necesitado de vuestra ayuda. *A la Dra. Simonetta Mattiucci, por darme la oportunidad de realizar una pasantía en los laboratorios de biología molecular del Instituto di Parassitologia, Università di Roma La Sapienza y el DECOS, Università degli Studi della Tuscia, Viterbo, Italia. *Al Centro de Estudios Parasitológicos y de Vectores (CEPAVE), por haberme brindado el espacio físico para realizar mis trabajos de tesis doctoral. * A la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica por haberme otorgado la beca Doctoral Interna; y al CONICET por haberme otorgado la beca de Postgrado Tipo II, y por financiar el proyecto de investigación con la que pude realizar las campañas de muestreo. *Al Dr. Marcelo Bertellotti y Lic. Cecilia Villanueva, por permitir incorporarme a su grupo de trabajo durante las campañas en la Estancia San Lorenzo de Península Valdés. *Al Dr. Flavio Quintana y Walter Svagelj, por permitirme acoplar a sus campañas de muestreo en la cormoranera de Punta León. *A mis amigos, que de alguna u otra forma, estuvieron siempre presentes y ayudaron a la concreción de esta tesis doctoral. II Resumen Los nemátodos Anisakidae tienen una amplia distribución mundial y sus ciclos de vida transcurren principalmente en hospedadores marinos (peces, cefalópodos, reptiles, aves piscívoras y mamíferos). El ciclo de vida generalmente involucra a invertebrados acuáticos como hospedadores intermediarios, peces como hospedadores intermediarios y/o paraténicos, y peces, reptiles, aves y mamíferos marinos como hospedadores definitivos. Hasta el momento, son escasos los antecedentes de investigación de Anisakidae en Argentina, lo cual alentó llevar a cabo las investigaciones del presente trabajo de tesis, para lo cual se planteó estudiar la taxonomía de los nematodos Anisakidae parásitos de aves marinas en Península Valdés, Chubut, Argentina. Las investigaciones se centralizaron en Península Valdés, aunque también se analizó material proveniente de Punta León y Bahía Bustamante (Chubut), Mar del Plata (Buenos Aires) y Cabo Vírgenes (Santa Cruz). Durante los años 2005 al 2008, se colectaron y examinaron un total de 161 ejemplares de Spheniscus magellanicus, 14 de Phalacrocorax atriceps albiventer, 12 de Phalacrocorax atriceps atriceps, 8 de Phalacrocorax brasilianus, 2 de Phalacrocorax magellanicus y 5 de Thalassarche melanophris. En la diagnosis de los nematodos se utilizó la un microscopía óptica y un electrónica de barrido. Se realizaron pruebas genético-moleculares, PCR de secuencias mitocondriales cox2 y electroforesis de alozimas. Se utilizaron el test de Anova a un factor y t-Estudent para evaluar la morfometría de las especies estudiadas, los tests de Máxima Parsimonia y Neighbour–Joining para analizar la diferenciación genética, los tests de Dice y Chi-cuadrado (X2) para evaluar la asociación parasitaria y los índices de Poulin & Muillot (2003, 2005) para evaluar la especificidad hospedatoria de los nematodos. Se confeccionó un checklist con un total de 79 especies válidas del género Contracaecum. Se identificaron 5 especies del género Contracaecum en Península Valdés, y otros sitios costeros del Mar Argentino además de una especie parásita de P. brasilianus de Chile y otra de Pelecanus occidentalis de Colombia, las cuales permitieron establecer comparaciones con los demás hallazgos del presente estudio. Tres de las especies identificadas resultaron ser nuevas: Contracaecum chubutensis, parásita de Phalacrocorax a. atriceps de Bahía Bustamante, y Contracaecum n. sp.1, parásita de Phalacrocorax magellanicus de Punta Loma y P. brasilianus de Península Valdés, Bahía Blanca y Chile; y III Contracaecum bioccai, parásita de Pelecanus occidentalis de Colombia. Se redescribieron 2 especies: Contracaecum pelagicum, parásita de S. magellanicus, T. melanophris y P. a. albiventer; y Contracaecum mirounga, parásita de S. magellanicus, hallazgo raro dado que esta especie parasita a fócidos. Contracaecum sp.2, parásita de S. magellanicus, representaría un nuevo taxón de Anisakidae, pero no pudo hacerse una diagnosis completa por la falta de material suficiente. Contracaecum pelagicum mostró una significativa cercanía genética con Contracaecum variegatum, que parasita a otros Spheniscidae australes y Alcidae boreales, y además una relación un poco más distante con C. bioccai, parásito de Pelecaniidae neotropicales. Contracaecum n. sp.1 mostró estar estrechamente emparentado con las escpecies de Contracaecum que parasitan a Phalacrocoracidae boreales: Contracaecum rudolphii A y B, parásitas de Phalacrocorax carbo sinensis; C. rudolphii C, parásita de Phalacrocorax verrucosus, y C. septentrionale, parásita de Phalacrocorax carbo carbo y Phalacrocorax aristotelis. Se analizó también la correspondencia específica entre las larvas L3 de los ítems presa predilectos (Engraulis anchoita) de algunas especies de aves (Spheniscus magellanicus) y los adultos que ellas albergan. Se corroboró, mediante una diagnosis morfológica y genético- molecular, que E. anchoita es una especie hospedadora intermediaria/paraténica de C. pelagicum. Se propuso inferir el proceso de maduración y distribución de los diferentes estadios en el hospedador definitivo (e.g. S. magellanicus) mediante el reclutamiento de larvas desde el primer mes de vida del pichón hasta los cuatro meses, cuando abandonan las costas y comienzan la migración. Se evaluó así el reclutamiento de larvas L3 y la distribución diferencial de larvas L4, preadultos y adultos en el esófago y estómago de S. magellanicus. Los análisis de reclutamiento de larvas de Anisakidae en S. magellanicus mostraron que los géneros Anisakis sp. e Hysterothylacium sp. tienen una mayor intensidad y prevalencia que C. pelagicum, sin embargo S. magellanicus no es el hospedador definitivo para aquellos estadios larvales. El reclutamiento y distribución de nematodes en el tracto digestivo de pichones de S. magellanicus demostraron que los adultos de C. pelagicum aparecen recién al tercer mes de vida del ave, incrementando notablemente las intensidades de preadultos y adultos al cuarto mes, final de la etapa de cría de S. magellanicus. Se identificaron las especies de Anisakidae presentes en los pellets y regurgitados de Phalacrocorax spp. y se analizó la asociación parasitaria con los ítems presa. Los datos de asociación parasitaria, tanto en pellets como en regurgitados, corroboran la estrecha relación de C. pelagicum y E. anchoita como hospedador intermediario/paraténico transmisor de IV larvas L3 al cormorán real, hospedador definitivo. Si bien Raneya brasiliensis mostró una asociación positiva, el posible ingreso de larvas L3 de C. pelagicum a través de este pez merece ser corroborada. Se estimó la especificidad hospedatoria de los anisákidos identificados en aves marinas de Península Valdés y en otras aves marinas neotropicales y antárticas. Los análisis de especificidad hospedatoria indicaron que C. mirounga es la especie más generalista (STD= 4,00), siendo específica a nivel de clase. Contracaecum pelagicum, en menor grado, resultó ser específica a nivel de orden de aves (STD= 3,83). Contracaecum chubutensis, C. bioccai y Contracaecum sp. n.1 resultaron ser estrictamente específicos (STD= 0), dado que parasitan a una sola especie hospedadora. Entre las restantes especies de distribución neotropical y antártica (24), Contracaecum travassosi y Contracaecum caballeroi (STD= 3.00) resultaron ser las más generalistas, siendo específicas a nivel de orden de aves. Contracaecum microcephalum (STD= 2,91), Contracaecum multipapillatum (STD= 2,67) y Contracaecum rudolphii (STD= 2,55) resultaron ser un poco más específicas también a nivel de orden. Contracaecum ogmorhini (STD= 2,40) mostró ser específico a nivel de familia de pinnípedos de ambos hemisferios. Contracaecum osculatum y Contracaecum radiatum son aún más específicos (STD= 2,00), parasitando a fócidos del hemisferio norte pertenecientes a tres géneros diferentes. Contracaecum heardi parasita a tres géneros diferentes de Spheniscidae antárticos (STD= 1,83). Contracaecum diomedae lo hizo en dos géneros diferentes de Diomedeidae también antárticos (STD= 1,50). Contracaecum ovale resultó ser altamente específico para dos géneros de Podicipedidae (STD= 1,33). Las especies Contracaecum antarticum, Contracaecum crenulatum, Contracaecum granulosum, Contracaecum macronectidis, Contracaecum plagiaticium, Contracaecum scotti y Contracaecum spheniscus resultaron ser estrictamente específicas al parasitar una sola especie hospedadora (STD= 0). De acuerdo al análisis morfométrico, genético-molecular y de revisión bibliográfica, se propuso diferenciar a Contracaecum spp. que parasitan aves marinas y mamíferos marinos neotropicales y antárticos en dos grandes grupos. El “morfo pelagicum”, caracterizado por tener un patrón de distribución de 7 papilas postcloacales: 2 pares paracloacales (o 1 par doble), 2 pares subventrales, 2 sublaterales y un par de fásmidos. En el se incluirían C. pelagicum, C. chubutensis, C. bioccai, C. antarticum, C. caballeroi, C. crenulatum, C. diomedeae, C. granulosum, C. heardi, C. macronectidis, C. microcephalum, C. ogmorhini, C. ovale, C. plagiaticium, C. scotti y C. spheniscus. El subgrupo “morfo travassosi”, incluido dentro del grupo anterior, parasita generalmente a Palacrocoracidae y morfológicamente se V separa de otros Contracaecum spp. por tener labios sin hendiduras, interlabios con una pequeña o ausente bifurcación, espículas más largas y constricciones cuticulares caudales. En el se incluyen C. travassosi, Contracaecum n. sp.1 y el complejo C. rudolphii. El otro grupo se denomina “morfo multipapilado” y se caracteriza por poseer dos hileras dobles de 12-13 papilas precloacales y 10-11 pares de papilas postcloacales: 1 par doble paracloacal, 5-6 pares adacloacales, 3 pares subventrales, 1 par sublateral y 1 par de fásmidos. En este grupo se incluyen a las especies que parasitan a mamíferos marinos boreales y australes: C. mirounga, C. osculatum, C. radiatum y C. multipapillatum. Contracaecum sp.2 no se corresponde con ninguno de los morfos sugeridos debido al raro patrón de distribución de las papilas caudales y la forma de los labios e interlabios. Los resultados muestran la necesidad de profundizar los estudios de especificidad hospedatoria en Anisakidae parásitos de Phalacrocoracidae, por estar bien respresentados a lo largo de la costa patagónica argentina y tener una especie continental (P. brasilianus). Complementar estos estudios con el conocimiento del rol que cumplen los diferentes ítems presa en la transmisión de Anisakidae a las diferentes especies de Phalacrocoracidae, permitirá inferir los ciclos de vida y ampliar aún más el conocimeinto de los Anisakidae en la Argentina. VI Abstract Anisakidae nematodes have a world wide distribution and their life cycles take place mainly in marine hosts: fish, cephalopods, reptiles, piscivorous birds and mammals. The life cycle usually involves aquatic invertebrates as intermediary hosts, fish as intermediary and/or paratenic hosts, and reptiles, birds and marine mammals as definitive hosts. At the moment, research reports on Anisakidae in Argentina are scarce which encouraged the research of the present thesis study to be carryed out. The taxonomy of Anisakidae nematodes parasitizing marine birds from Península Valdés, Chubut, Argentina, was outlined to be studied. The research was focused on the Península Valdés even though avian material from Punta León y Bahía Bustamante, Chubut province, Mar del Plata, Buenos Aires province, and Cabo Vírgenes, Santa Cruz province was analized during years 2005 to 2008. A total of 161 individuals of Spheniscus magellanicus, 14 of Phalacrocorax a. albiventer, 12 of Phalacrocorax a. atriceps, 8 of Phalacrocorax brasilianus, 2 of Phalacrocorax magellanicus, and 5 of Thalassarche melanophris were collected and examined. Light and scanning electron microscopies were used in the nematode diagnosis. Molecular genetics from PCR of mitocondrial DNA secuences cox2 and electrophoresis of alozimes were done. One-factor Anova and t-Estudent tests were used to evaluate the studied species morphometry, Maximum Parsimony and Neighbor–Joining tests to analyze the genetic diferentiation, Dice and Chi-cuadrado (X2) tests to evaluate the parasite association, and the Poulin & Muillot indexes (2003, 2005) to evaluate the nematode host specificity. A checklist with a total of 79 valid species from the genus Contracaecum was made up. Five species of the genus Contracaecum from Península Valdés and other coastal sites from the Argentinean Sea were identified. One species of Contracaecum was identified parasitizing P. brasilianus from Chile and another one from Pelecanus occidentalis from Colombia which allowed stablishing comparations with the other present study findings. Three indentified species turned out to be new: Contracaecum chubutensis parasitizing Phalacrocorax a. atriceps from Bahía Bustamante, Chubut, and Contracaecum n. sp.1 parasitizing Phalacrocorax magellanicus from Punta Loma, Chubut, and P. brasilianus from Península Valdés, Bahía Blanca, Buenos Aires, and Chile; and Contracaecum bioccai parasitizing Pelecanus occidentalis from Colombia. Two species were redescribed: Contracaecum pelagicum parasitizing S. magellanicus, T. melanophris, and P. a. albiventer; VII and Contracaecum mirounga parasitizing S. magellanicus, rare finding since this species parasitize phocids. Contracaecum sp.2 parasitizing S. magellanicus would represent a new Anisakidae taxon but no complete diagnosis could be done the lack of enough material. Contracaecum pelagicum showed a significative proximity with Contracaecum variegatum parasitizing other austral Spheniscidae and boreal Alcidae, and also a little more distant relationship with C. bioccai, parasite of neotropical Pelecaniidae. Contracaecum n. sp.1 showed to be estar closely related with the Contracaecum species which parasitize boreal Phalacrocoracidae: Contracaecum rudolphii A and B parasitizing Phalacrocorax carbo sinensis; C. rudolphii C parasitizing Phalacrocorax verrucosus, and C. septentrionale parasitizing Phalacrocorax carbo carbo and Phalacrocorax aristotelis. The specific correspondence between L3 larvae from main prey items (Engraulis anchoíta) from some marine birds (Spheniscus magellanicus) and adults that they host was analyzed. Through a morphological and molecular genetic diagnosis, the fact that E. anchoita is an intermediate/paratenic from C. pelagicum was corroborated. The maduration process and distribution of different Contracaecum stages in the definitive host (S. magellanicus) was proposed through the larvae recruitment from the one- month old nestling to the four-month old one, when they leave coast and begin migration. Larvae L3 recruitment and differential distribution of larvae L4, pre-adults and adultos in penguin esophagus and stomach were evaluated. Analysis of Anisakidae larvae recruitment from S. magellanicus showed that genera Anisakis sp. and Hysterothylacium sp. have a higger intensity and prevalence than that of C. pelagicum. However, S. magellanicus is not the definitive host to these two last larvae genera. Recruitment and distribution of nematodes in the digestive tract of S. magellanicus nestlings showed that C. pelagicum adults appear just in the third month age of nestlings increasing notably intensities of pre-adults and adults on the fourth month age, the breading season ending of S. magellanicus. The Anisakidae species in pellets and regurgitates from Phalacrocorax spp. were identified and the parasite association of cormorant prey items was analyzed. Parasite association data as much in pellets as regurgitates corroborate the close relationchip of C. pelagicum and E. anchoita as intermediate/paratenic host transmitter of larvae L3 to the royal cormorant, definitive host. Although Raneya brasiliensis showed a positive association, the possible C. pelagicum larvae L3 access through this fish species deserves to be corroborated. Host specificity of the identified anisakids parasitizing marine birds from Península Valdés and other neotropical and antartic ones was estimated. VIII Host specificity analysis indicated that C. mirounga is the most generalist species (STD= 4,00), being specific at the class level. Contracaecum pelagicum turned out to be specific at a bird order level (STD= 3,83). Contracaecum chubutensis, C. bioccai and Contracaecum sp. n. 1 showed to be strictly specific (STD= 0) since thay parasitize only one species. Among remaining neotropical and antartic species (24), Contracaecum travassosi and Contracaecum caballeroi (STD= 3.00) turned out to be the most generalists being specific at a bird order level. Contracaecum microcephalum (STD= 2,91), Contracaecum multipapillatum (STD= 2,67), and Contracaecum rudolphii (STD= 2,55) were more specific also at a bird order level. Contracaecum ogmorhini (STD= 2,40) was specific at a pinniped family level from both hemispheres. Contracaecum osculatum and Contracaecum radiatum were even more specific (STD= 2,00) parasitizing phocids from the boreal hemisphere belonging to three different genera. Contracaecum heardi parasitizes three different genera of antartic Spheniscidae (STD= 1,83). Contracaecum diomedae parasitizes two different genera of antartic Diomedeidae too (STD= 1,50). Contracaecum ovale turned out to be highly specific to two genera of Podicipedidae (STD= 1,33). The species Contracaecum antarticum, Contracaecum crenulatum, Contracaecum granulosum, Contracaecum macronectidis, Contracaecum plagiaticium, Contracaecum scotti y Contracaecum spheniscus were strictly specific for parasitizing only one host species (STD= 0). According to the morphological analysis, molecular genetic and bibliography revision, Contracaecum spp. parasitizing marine birds were proposed to be differentiates in two big grups. The “morpho pelagicum” is characterized a papillae distribution pattern as 7 postcloacal papillae pairs: 2 paracloacal pairs (or a doble one), 2 subventral pairs, 2 sublateral pairs and a phasmid pair. This grupo would include C. pelagicum, C. chubutensis, C. bioccai, and the neotropical and antartic species C. antarticum, C. caballeroi, C. crenulatum, C. diomedeae, C. granulosum, C. heardi, C. macronectidis, C. microcephalum, C. ogmorhini, C. ovale, C. plagiaticium, C. scotti, and C. spheniscus. The subgrup “morpho travassosi” is within the latter grup and parasitizes usually Palacrocoracidae. Morphologically is separate from the other Contracaecum spp. for having lips without notches, interlabia with a tiny or absent bifurcation, longer spicules and caudal cuticular constrictions. Within it C. travassosi, Contracaecum n. sp.1 and the complex C. rudolphii A, B y C are included. The “morpho multipapilado” is characterized for having two double rows of 12-13 precloacal papilae and 10-11 postcloacal papillae pairs: 1 double paracloacal pair, 5-6 adacloacal pairs, 3 subventral pairs, 1 sublateral pair and 1 phasmid pair. Within this grup the species that parasitize boreal and austral marine mammals are included: C. mirounga, C. osculatum, C. radiatum, and C. IX multipapillatum. Contracaecum sp.2 does not match with none of the suggested morphos due to the rare distribution pattern of caudal papillae and the interlabia and lip shape. Results showed the need make further studies on Anisakidae host specificity parasitizing Phalacrocoracidae since is a well-represented grup with several species distributed along the Argentinean Patagonian cost with a continental representative (P. brasilianus). In the same way, what is the role that different prey items of Phalacrocoracidae attain in the Anisakidae transmition to birds should be evaluated taking into account that those one are potential prey items and nematode transmitters to marine mammals from the zone. With the gathered information, infering on life cycles of identified Anisakidae species parasitizing marine birds could be done. X Introducción General Introducción General El parasitismo es una interacción íntima y permanente entre dos organismos heteroespecíficos, el hospedador y el parásito, cuyas historias de vida están sincronizadas, de tal modo que el parásito depende metabólicamente del hospedador (Marcogliese & Price, 1997; Graczyk & Fried, 2001). Sin embargo, un parásito, bajo ciertas condiciones, puede actuar como un comensal, un mutualista o un predador, y en la mayoría de los casos se conoce muy poco acerca del parásito para establecer qué tipo de relación tiene con el hospedador (Rohde, 2005). De esta forma se trata de comprender la idea de complementación genética e interdependencia metabólica que demuestran los atributos esenciales de las asociaciones parasitarias (Esch & Fernández, 1993). Así, los parásitos son componentes casi invisibles de las comunidades animales y generalmente ejercen una variada influencia sobre sus hospedadores. En este sentido los parásitos son capaces de promover que los hospedadores se vuelvan genéticamente más diversos, causando la evolución de los mismos en respuesta a nuevas adaptaciones parasitarias. Si un hospedador no evoluciona metabólicamente, muere y el parásito perece junto con él, impidiendo de esta forma el establecimiento del parasitismo (Combes, 2001). En relación con este aspecto, debe considerarse también que los diferentes estadios larvales y adultos de los parásitos generan demandas energéticas que pueden afectar el estado nutricional y ocasionar deficiencias en el crecimiento de sus hospedadores, aumentando la mortalidad o disminuyendo la natalidad (Marcogliese & Price, 1997). A pesar de estas consideraciones, los parásitos generalmente atraen la atención sólo cuando causan patologías, enfermedades o daños económicos, por el contrario, los parásitos resultan ignorados en los estudios de manejo y conservación de los ecosistemas (Marcogliese, 2004). En este contexto, la enorme variedad de ambientes y las condiciones del medio marino particularmente, hacen que cada organismo marino sea un hospedador potencial para un parásito, dependiendo del sitio, la estación, la ecología local y la especie parásita en cuestión. Así cualquier hospedador es candidato y podría estar o no parasitado (Rohde, 2005). Pero el 1 Introducción General modo de transmisión y habilidad de dispersión de los parásitos determinan el grado de especificidad parasitaria (Pedersen et al., 2005). La especificidad hospedatoria es uno de los principales atributos de los parásitos y se relaciona con el número de especies hospedadoras explotadas por una especie parásita, denominándose “específicos” a aquellos presentes en una sola especie hospedadora y “generalistas” a los parásitos hallados en diferentes especies hospedadoras (Poulin et al., 2006). Entre los endoparásitos, el phylum Nematoda es biológica y ecológicamente diverso y es uno de los mayores y más exitosos grupos dentro del reino animal. Los nematodos son componentes ubicuos en las comunidades de la mayoría de los ambientes marinos y terrestres (Anderson, 2000). Pueden colonizar casi todos los ambientes del planeta, desde el fondo de los océanos, los desiertos helados de la Antártida, hasta los suelos y pantanos terrestres, con una abundancia numérica increíble (Kennedy & Harnett, 2001). En el medio marino, los nematodos tienen una amplia distribución y la gran mayoría de las especies pertenece a formas de vida libre, sólo una minoría está conformada por los endoparásitos. Los Anisakidae son nematodos ascaridoideos cuyos ciclos de vida se cumplen en invertebrados y peces, como hospedadores intermediarios y/o paraténicos, y generalmente en peces, aves y mamíferos marinos, como hospedadores definitivos (Anderson, 2000; Rohde, 2005). La heteroxenia (uso de hospedadores intermediarios) caracteriza a los ciclos de vida y la paratenesis (uso de hospedadores de transporte) es muy común (Rohde, 2005). Anderson (1996), consideró que los nematodos parásitos marinos evolucionaron primitivamente en hospedadores terrestres y posteriormente fueron capaces de invadir los ambientes acuáticos, luego de haber desarrollado los mecanismos de heteroxenia y paratenesis. Varios estudios taxonómicos sobre Anisakidae han sido realizados hasta el presente, sobre todo en aquellos parásitos de peces, aves y mamíferos marinos boreales (Hartwich, 1964, Berland, 1989; Fagerholm, 1988; 1990, entre otros). Sin embargo la taxonomía de este grupo sigue siendo confusa en la actualidad, debido a la gran similitud que presentan los caracteres morfológicos diagnósticos entre las distintas especies, más aún si se consideran los estadios larvales, resultando casi imposible establecer la correspondencia específica entre larvas y adultos de una misma especie. No obstante, la aplicación de técnicas genético- moleculares aporta una solución a esta problemática (Orecchia et al., 1986; Mattiucci et al., 2003; Mattiucci & Nascetti, 2008). En este contexto, los primeros estudios parasitológicos del Mar Argentino comenzaron en la década del ´50 con los trabajos de Szidat (1950, 1962, 1963, entre otros) y entre los años 2 Introducción General ´70 y ´80, Ostrowski de Núñez (1971, 1973), Suriano & Martorelli (1983 a, b), contribuyeron al conocimiento de la parasitofauna de ambientes marinos. Posteriormente, nuevas investigaciones permitieron ampliar el conocimiento sistemático-biológico de helmintos, con mayor preponderancia en peces e invertebrados de diferentes áreas del Mar Argentino (Ivanov et al., 1997; Sardella et al., 1997; Cremonte & Sardella, 1997; Tanzola et al., 1997; 1998; Martorelli & Cremonte, 1998; Navone et al., 1998; Cremonte, 1999; Cremonte & Navone, 1999; Cremonte et al., 1999; Martorelli et al, 2000; Timi et al. 2001; Timi, 2003; Tanzola & Sardella, 2006; Carballo & Navone, 2007; Carballo, 2008). Si bien las aves marinas han recibido mucha atención con respecto a su ecología, comportamiento y sistemática, los estudios referidos a su parasitofauna han sido de poco interés para los investigadores (Hoberg, 1996). En Argentina, los primeros trabajos sistematizados de la fauna parasitaria de aves marinas y dulceacuícolas se conocen a través de Szidat (1964), Ostrowski de Núñez (1970), Martorelli (1981), Etchegoin & Martorelli (1997), Cremonte & Martorelli (1998), Digiani (1999) y Labriola (1999). Específicamente, en el área de Península Valdés, los trabajos parasitológicos se iniciaron a partir de 1999 en aves, peces y moluscos (Cremonte, 2001; Cremonte et al., 2001a, b; Cremonte & Etchegoin, 2002; Cremonte, 2004; Carballo et al., 2007). Paralelamente, algunos de estos trabajos se centralizaron en el conocimiento sistemático-biológico de los nemátodos de aves marinas (Laurenti et al., 1997; Diaz et al., 2001; Cremonte et al., 2002; Diaz et al., 2004; 2005, 2007; Diaz, 2006, Escudero et al., 2007), y unos pocos precisamente en nematodos Anisakidae (Navone et. al., 2000; Pazos et al., 2000; 2003). Teniendo en cuenta los escasos aportes sobre la diversidad y biología de anisákidos en aves marinas del Mar Argentino, este trabajo de tesis indaga sobre las siguientes cuestiones: * ¿Diferentes especies de aves marinas piscívoras están parasitadas por las mismas especies de anisákidos? * ¿Contracaecum pelagicum parasita únicamente a S. magellanicus o lo hace también en otras aves ictiófagas de la zona (e.g., Phalacrocorax spp., Talassarche sp.)? * ¿Qué especificidad hospedatoria poseen estas especies de Anisakidae? * ¿Distintas especies de anisákidos coexisten en una misma especie hospedadora? * ¿Las larvas de tercer estadio (e.g., Contracaecum spp.) encontradas en los peces ítems presa corresponden a las larvas de cuarto estadio y adultos encontradas en las aves? * Si diferentes especies de aves son parasitadas por una misma especie parásita: ¿cuál o cuáles representan al hospedador primario o preferencial? 3 Introducción General *¿El conocimiento de las redes tróficas que involucran a los sistemas hospedador-presa estudiados y la identificación de cada estadio observado, permite sugerir el ciclo de vida de los anisákidos identificados? *¿El análisis de los bolos regurgitados y pellets de Phalacrocorax spp. permite identificar las especies de anisákidos que están presentes en la dieta de éstas aves? ¿Qué asociación parasitaria existe entre los anisákidos y los ítems presa encontrados? * ¿Es posible identificar las especies de Anisakidae que parasitan a los Phalacrocoracidae a través de los pellets? *¿El hábito de la regurgitación regula las poblaciones de esos parásitos? Objetivos Para responder a estos interrogantes se plantearon los siguientes objetivos: General: - Conocer la diversidad de los Anisakidae adultos y evaluar su especificidad hospedatoria en aves marinas piscívoras que habitan el área de la Península de Valdés. Específicos: - Caracterizar cuali y cuantitativamente los nematodos adultos Anisakidae presentes en S. magellanicus, Phalacrocorax spp. y T. melanophris, que frecuentan las costas de la Península Valdés. - Clarificar la composición taxonómica de los anisákidos adultos y estimar su diversidad describiendo o redescribiéndolos, mediante el uso de diferentes técnicas (MEB; electroforesis de isoenzimas, genética molecular cualitativa). - Estimar siempre que fuese posible la prevalencia y abundancia de cada especie de Anisakidae en las diferentes especies hospedadoras, con el fin de dilucidar el carácter de hospedador primario o preferencial. - Sobre la base del conocimiento de los ítems presa, colectar e identificar los individuos de los diferentes estadios juveniles y proponer el diseño de los ciclos de vida cuando fuera posible. - Establecer la correspondencia específica de las larvas de tercer estadio (L3) encontradas en los peces ítems presa con las de cuarto estadio (L4) y adultos encontrados en las aves. - Identificar las especies de Anisakidae presentes en los pellets de aves con hábitos regurgitadores (e. g. Phalacrocorax spp.), y analizar la asociación parasitaria de los ítems presa, larvas y de adultos de Anisakidae. 4 Introducción General - Estimar la especificidad hospedatoria de los anisákidos que parasitan a estas aves y a los items presa de las mismas. 5 Taxonomía de Anisakidae Capítulo 1 Taxonomía de Anisakidae Introducción Áreas de muestreo Las investigaciones de la presente Tesis se centralizaron en Península Valdés, aunque estudios complementarios fueron llevados a cabo en Punta León y Bahía Bustamante, ambos sitios pertenecientes a la provincia del Chubut; Mar del Plata, en la provincia de Buenos Aires y Cabo Vírgenes, en la provincia de Santa Cruz (Fig. 1). Todos los muestreos fueron realizados en colonias nidificantes de las aves objeto de estudio, de acuerdo a con la disponibilidad del material. La Península Valdés se caracteriza por ser una amplia meseta con una extensión de aproximadamente 4.000 km2 con suaves o bruscas vertientes hacia el mar. Se extiende desde los 42º04’13” a los 42º53’32” de latitud sur y desde los 63º35’51” a los 64º36’37” de longitud oeste. La mayor parte de los muestreos se realizaron en la estancia San Lorenzo, ubicada en el nordeste de Península Valdés, entre los 42° 04´ y 42° 10´ de latitud sur y los 63° 50´ y 63° 56´ de longitud oeste limitando al norte con el Golfo San Matías y al este, sur y oeste con campos de propiedad privada. La misma tiene una superficie de 5.134 ha. con unos 4,6 km de costa (totalmente sobre el Golfo San Matías) formada por playas de canto rodado con y sin acantilados y en menor proporción playas de sedimentos con restingas. Fisiográficamente el área está ubicada en una zona intermedia entre los denominados cordones litorales marinos y los acantilados de ambiente marino. En el centro del campo, se encuentran algunos médanos móviles frente a los acantilados (Fig. 2). La avifauna costera está constituida principalmente por una colonia de nidificación de pingüino de Magallanes, Spheniscus magellanicus Forster (Spheniscidae); además existe un núcleo de nidificación de la gaviota cocinera Larus dominicanus Lichtenstein (Laridae) y algunos nidos de garza bruja Nycticorax nycticorax Linnaeus (Ardeidae) (Boltovskoy, http://atlas.ambiente.gov.ar/). 6 Taxonomía de Anisakidae La Reserva Provincial de Punta León (43º04'44" S, 64º29'45" O), se sitúa a 80 km de la ciudad de Puerto Madryn, Chubut, y a 25 km al sur de la boca del Golfo Nuevo. Se extiende a lo largo de tres kilómetros de costa, al pie de acantilados de 70 m de altura. La costa posee playas de canto rodado y extensas restingas. En un sector de costa el mar está separado de los acantilados por una plataforma arcillosa cubierta por vegetación arbustiva (Fig. 2). Presenta una gran diversidad y abundancia de aves marinas, con importantes colonias de gaviota cocinera -L. dominicanus-, gaviotín real -Thalasseus maximus Boddaert-, gaviotín pico amarillo -Thalasseus sandvicensis Latham- (Laridae), cormorán real -Phalacrocorax [atriceps] albiventer Lesson- y biguá -Phalacrocorax brasilianus Gmelin- (Phalacrocoracidae). También nidifican el cormorán cuello negro -Phalacrocorax magellanicus Gmelin-, cormorán guanay -Phalacrocorax bougainvillii Lesson- (Phalacrocoracidae), ostrero negro -Haematopus ater Vieillot & Oudart- y ostrero común - Haematopus palliatus Temminck- (Haematopodidae). Se observa la presencia regular del gaviotín sudamericano -Sterna hirundinacea Lesson-, gaviota austral -Larus scoresbii Traill- (Laridae), petrel gigante del sur -Macronectes giganteus Gmelin- (Procellariidae) y paloma antártica -Chionis alba Gmelin- (Chionididae) (Boltovskoy, http://atlas.ambiente.gov.ar/). La Bahía Bustamante incluye sectores de playa, acantilados, plataformas de abrasión y marismas. Predomina la grava arenosa con restos de conchas de moluscos en diferente grado de conservación y las playas arenosas están restringidas a pequeñas bahías o caletas. Son áreas de poca profundidad y zonas con amplias restingas (Fig. 2). Es un área de nidificación de aves marinas y costeras, incluyendo aves playeras neárticas y patagónicas como el pingüino de Magallanes, el cormorán imperial -Phalacrocorax [atriceps] atriceps King- (Phalacrocoracidae), el cormorán roquero, el cormorán de cuello negro, el petrel gigante del sur, gaviotas, gaviotines, el playero rojizo -Calidris canutus Linnaeus, el playerito de rabadilla blanca -Calidris fuscicollis Vieillot-, la becasa de mar -Limosa haemastica Linnaeus- (Scolopacidae), pato vapor cabeza blanca -Tachyeres leucocephalus Humphrey & Thompson- (Anatidae) y la gaviota de Orlog -Larus atlanticus Olrog- (Laridae) (Boltovskoy, http://atlas.ambiente.gov.ar/). La costa de Mar del Plata posee acantilados labrados en loess y limos pampeanos, de altura cada vez mayor, mientras que las playas se reducen en tamaño. Al sur de Santa Clara del Mar dominan los acantilados, de hasta unos 20 m de altura, con pequeñas playas de bolsillo (Fig. 2). Abundan las aves marinas costeras y muchas de las típicas para las lagunas pampeanas como el cisne de cuello negro -Cygnus melancoryphus Molina- 7 Taxonomía de Anisakidae (Anatidae), el cisne coscoroba -Coscoroba coscoroba Molina- (Anatidae) el pato maicero - Anas georgica Gmelin-, el pato colorado (Anas cyanoptera Vieillot) (Anatidae), el chorlo doble collar -Charadrius falklandicus Latham- (Charadriidae), la gaviota cocinera, la gaviota de capucho gris -Larus cirrocephalus Vieillot-, gaviota capucho café -Larus maculipennis Lichtenstein- (Laridae) y la gaviota de Olrog, entre otras (Boltovskoy, http://atlas.ambiente.gov.ar/). El Cabo Vírgenes (52°16' a 52°55' S, 68°02' a 69°22' O) presenta acantilados activos e inactivos con cordones que se adosan al pie. Es una lengua baja de arena y cascajo que se extiende al sudoeste del cabo; las costas este y oeste son playas. Al norte y al sur las costas son acantiladas, en todo ese sector se observan playas de grava y arenosas con alta pendiente (Fig. 2). Incluye una de las mayores colonias de la Patagonia del pingüino de Magallanes, con aproximadamente 90.000 parejas. También incluye colonias reproductivas de la gaviota cocinera, el cormorán de cuello negro, el cormorán imperial, el biguá y la bandurria austral -Theristicus melanopis Gmelin- (Threskiornithidae). Otras aves presentes en el área son el macá grande. Podiceps major Boddaert- (Podicipedidae), la garza bruja, el flamenco común -Phoenicopterus ruber Linnaeus- (Phoenicopteridae), el cauquén común - Chloephaga picta Gmelin- (Anatidae), el chorlito doble collar, la paloma antártica y el eskúa antártico -Catharacta antarctica Lesson- (Stercorariidae) (Boltovskoy, http://atlas.ambiente.gov.ar/). 8 Taxonomía de Anisakidae Cabo Vírgenes Bahía Bustamante Ea. San Lorenzo Península Valdés Punta León Mar del Plata Figura 1. Fotografía satelital de la parte sur de Argentina con fotografías de los sitios de muestreo. 9 Taxonomía de Anisakidae Figura 2. Fotografías de los sitios de muestreo mostrando el aspecto del relieve costero. a) Estancia San Lorenzo, Península Valdés; b) Pingüinera de la Estancia San Lorenzo; c) Punta León; d) Pingüinera de la Bahía Bustamante; e) Mar del Plata, foto aérea; f) Cabo Vírgenes. 10 Taxonomía de Anisakidae Los hospedadores En la zona de Península Valdés y los golfos nordpatagónicos se han registrado un total de 73 especies de aves, de las cuales sólo 29 nidifican y se reproducen en el área, 10 de ellas no lo hacen aunque utilizan distintos ambientes de la península y 34 son de presencia accidental u ocasional. Entre las aves más frecuentes se pueden mencionar distintas especies de gaviotas Larus spp., cormoranes Phalacrocorax spp., albatros Thalassarche spp., petreles Macronectes spp., macáes Podiceps spp., ostreros Haematopus spp., flamencos Phoenicopterus spp., y aves migratorias, Spheniscidae, Charadriidae y Scolpacidae (Boltovskoy, http://atlas.ambiente.gov.ar/). En la presente investigación se trabajó sobre el pingüino de Magallanes -Spheniscus magellanicus Forster- (Spheniscidae) (Fig. 3a), que se distribuye en varias colonias a lo largo de la costa de Península Valdés, siendo la colonia de la estancia San Lorenzo la más numerosa (≈ 55.000 parejas) (Wilson et al., 1995; Scolaro et al., 1999). El pingüino de Magallanes nidifica desde el Cabo de Hornos hasta Península Valdés en el Océano Atlántico, desde Tierra del Fuego hasta el paralelo 29ºS en Chile sobre el Pacífico y alrededor de las Islas Malvinas. Durante el período no reproductivo las aves realizan una migración hacia el norte llegando al sur de Brasil por el este y alcanzando la costa de Perú por el oeste (Frere et al., 1996; Yorio et al., 1998). El cormorán real o de vientre blanco -Phalacrocorax [atriceps] albiventer (Lesson)- (Phalacrocoracidae) (Figs. 3c, d), se distribuye desde los 45ºS hasta el Canal de Beagle, Tierra del Fuego, sobre la costa argentina; la distribución del lado chileno alcanza menores latitudes (Frere et al., 2005). También se localizan colonias en las Islas Malvinas, islas antárticas, algunas islas sudafricanas y Nueva Zelanda (Rasmussen, 1994; del Hoyo et al., 1996). En Península Valdés esta especie se distribuye en colonias nidificantes puntuales. Para esta investigación se escogió la colonia de Punta León, ubicada en el extremo sur del golfo Nuevo, constituida por unas 35.000 parejas (Svagelj & Quintana, 2007). En las colonias sureñas es común observar al cormorán real nidificando junto con el otro morfo de la especie, el cormorán imperial -Phalacrocorax [atriceps] atriceps King- (Phalacrocoracidae), de hábito trófico similar. La taxonomía de Phalacrocorax atriceps aún es motivo de discusión y podrían producirse cambios en su nomenclatura (Rasmussen, 1994). El biguá o cormorán oliváceo -Phalacrocorax brasilianus Gmelin- (Phalacrocoracidae) (Fig. 3b), es uno de los cormoranes mayoritariamente distribuidos en casi todo el continente americano, desde el sur de los EEUU hasta el cabo de Hornos. Es notablemente 11 Taxonomía de Anisakidae versátil en el uso de hábitats (Telfair & Morrison, 1995), habitando costas marítimas, lagos, lagunas y ríos de agua dulce. Es un residente permanente bien representado en Península Valdés y algunas poblaciones migran al norte durante el invierno (Quintana et al., 2002, 2004). El cormorán roquero o de cuello negro -Phalacrocorax magellanicus Gmelin- (Phalacrocoracidae) (Fig. 3f), se distribuye desde el noroeste de Península Valdés, Chubut, hasta el Canal de Beagle, Tierra del Fuego, incluyendo Islas Malvinas e Isla de los Estados (Frere et al., 2005). Su población se distribuye en 143 colonias de tamaño pequeño y presenta una población reproductiva total de aproximadamente 7.000 parejas. La colonia de Punta Loma (Chubut), es una de las más numerosas a lo largo de todo el rango de distribución de esta especie (Sapoznikow, 2006). El albatros ojeroso o de ceja negra -Thalassarche (=Diomedea) melanophris Temminck- (Diomedeidae) (Fig. 3e) es una de las especies más comunes en aguas del Océano Atlántico Sur y norte de la Antártida. Por lo general se distribuye entre latitudes sur de 30º y 60º, aunque algunos se han registrado en las costas de Europa y Kenya. Es especialmente abundante en la costa patagónica argentina, tanto en invierno como en verano, donde forma bandadas de hasta varios miles de individuos que se concentran para alimentarse. Se reproduce de agosto a mayo en Islas del Cabo de Hornos, Islas de los Estados, Georgias del Sur y Malvinas. No posee colonias nidificantes en Península Valdés, su presencia en las costas se debe a la abundancia de sus presas en este sitio (Montalti & Orgeira, 1998). 12 Taxonomía de Anisakidae Figura 3. Los hospedadores. a) Spheniscus magellanicus, b) Phalacrocorax brasilianus, c) Phalacrocorax a. atriceps, d) Phalacrocorax a. albiventer, e) Thalassarche melanophris, f) Phalacrocorax magellanicus. 13 Taxonomía de Anisakidae Los parásitos: Nematoda, Ascaridida, Anisakidae Los nematodos de la familia Anisakidae tienen una amplia distribución mundial y sus ciclos de vida transcurren principalmente en hospedadores marinos (peces, cefalópodos, tortugas, aves piscívoras y mamíferos). El ciclo de vida generalmente involucra invertebrados acuáticos como hospedadores intermediarios, peces como hospedadores intermediarios y/o paraténicos, y aves y mamíferos como hospedadores definitivos (Fagerholm, 1990; Anderson, 2000; Rhode, 2005). Los nematodos adultos maduran en el tubo digestivo de los hospedadores vertebrados acuáticos y eliminan los huevos junto con las heces del hospedador. En el agua, los huevos embrionan a larvas de primer estadio (L1), éstas se desarrollan y luego realizan la primera muda, convirtiéndose en larvas de segundo estadio (L2). Las larvas L2 retienen la cutícula del primer estadio, eclosionan dentro del agua y son ingeridas por invertebrados, generalemente copépodos, hospedadores intermediarios. En el hemocele, las larvas crecen levemente o considerablemente, dependiendo de la especie y mudan a larvas de tercer estadio (L3), según algunos autores. (Anderson, 2000, Rohde, 2005). Los peces ingieren estos invertebrados, la larva L3 migra en el interior del nuevo hospedador paraténico y/o intermediario, y se encapsula en el mesenterio. Posteriormente, los peces son ingeridos por los vertebrados homeotermos, las L3 se desenquistan instalándose en la mucosa esofágica y gástrica del hospedador y mudan, convirtiéndose en larvas del cuarto estadio (L4), las cuales al volver a mudar se convierten en adultos, continuando el ciclo de vida (Anderson, 2000; Rohde, 2005). Con respecto a las patolologías causadas por los Anisakidae en sus hospedadores definitivos, existen escasos estudios detallando estas afecciones por lo que se conoce muy poco. Fagerholm et al. (1996) observaron una respuesta inflamatoria de la mucosa del proventrículo de Anus minutus (Laridae) con altas cargas parasitarias de Contracaecum magnipapillatum Chapin, 1925, formando lesiones nodulares fibrosas y ulceradas. Sin embargo, los autores sostienen que los nematodos no estarían alimentándose del tejido del hospedador y que este cuadro patológico no tendría el potencial para causar la muerte en el ave, salvo que se produjese alguna infección bacteriana secundaria que culmine en una peritonitis letal. Por otra parte, es conocida la patología causada en el ser humano al consumir pescado crudo o mal cocido, la cual se denomina Anisakidosis. Ello ocurre cuando se ingieren larvas de tercer estadio de los géneros Anisakis y Pseudoterranova comúnmente, que se encapsulan en las paredes estomacales causando graves trastornos gástricos como náuseas, vómitos y alergias graves (Buendía, 1997; Beldsoe & Oria, 2001). 14 Taxonomía de Anisakidae Taxonomía La taxonomía de los anisákidos es todavía confusa, principalmente la de los estadios larvales y/o juveniles (Berland & Fagerholm, 1994) y es poco conocida aún la diversidad que muestra la familia. La clasificación actual se basa principalmente en los rasgos morfológicos observados al microscopio óptico, tales como las estructuras cefálicas, bucales y faríngeas, detalles cuticulares, sistema reproductor masculino (espículas) y extremo posterior (papilas pre y postcloacales). Estos caracteres en algunos casos no resultan suficientes, por lo cual los estudios genético-moleculares contribuyen a su clasificación (D’Amelio et al., 2000; Mattiucci et al., 2003). En este sentido, los taxónomos han debido enfrentar los limitados caracteres morfológicos que ofrecen los anisákidos y frecuentemente resolver el problema de especies crípticas o gemelas (del inglés: sibling), cuando refieren a especies morfológicamente idénticas, pero genéticamente disímiles (Orecchia et al., 1986; Nascetti et al., 1993; D’Amelio et al., 2000; Mattiucci et al., 2003; Tanzola, 2004). Además resulta imposible establecer la correspondencia específica entre larvas y adultos si sólo se realizan estudios morfométricos. Por ello, el uso de técnicas moleculares, como la electroforesis multilocular de marcadores aloenzimáticos y la PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) de genes mitocondriales y ribosómicos, permiten avanzar en la verdadera identidad específica y en la dilucidación de la correspondencia entre larvas y adultos, entre otras aplicaciones (Kennedy & Harnett, 2001). Particularmente, el género Contracaecum se compone de 79 especies consideradas válidas (ver Checklist). 15 Taxonomía de Anisakidae Contracaecum spp. Referencias Hospedador Tipo Otros Hospedadores Area de Distribución C. accipiterum Accipiter gentilis China Shen, 1981 C. accipitris Sarcogyps calvus India Inglis, 1954 C. aduncum Gadus morhua Alemania Rudolphi, 1802 Baylis, 1920 Gadus morhua EEUU C. antarticum Pygoscelis adelia Antártida Johnston, 1938 C. bancrofti Pelecanus conspicillatus Australia Johnston & Mawson, 1941 Johnston & Mawson, 1941 Pelecanus eryhrorhynchus Méjico C. bioccai Pelecanus occidentalis Colombia Mattiucci et al., 2008 C. bodenheimeri Puffinus kuhli Egipto Witenberg, 1929 C. bubakii Phalacrocorax niger India Akram, 1996 C. caballeroi Anhinga anhinga Méjico Bravo Hollis, 1939 Lent & Freitas, 1948 Phalacrocorax brasilianus Uruguay C. carlislei Microcarbo africana africanoides Sudáfrica Ortlepp, 1938 Barson & Marshall, 2004 Phalacrocorax africanus Zimbabwe Barson & Marshall, 2004 Anhinga melanogaster Zimbabwe C. circi Circus Cyaneus Rusia Oschmarin, 1953 Buteo buteo Rusia Buteo lagopus Rusia C. clavatum Gaddus morhua Alemania Rudolphi, 1809 C. crenulatum Cancroma cochlearia Brasil Schuurmans-Stekhoven, 1937 Phalacrocorax a. atriceps Bahía Bustamante, Chubut Garbin et al., 2008 C. chubutensis Checklist del género Contracaecum (Anisakidae). 16 Taxonomía de Anisakidae C. diomedeae Diomedea brachyura Antártida Linstow, 1888 Johnston, 1938 Diomedea exulans Antártida Johnston, 1938 Diomedea nigripes Antártida Johnston, 1938 Phoebetria palpebrata Antártida Leiognathus daura India upta & Srivastava, 1985 Eudyptes cristatus Nueva Zelanda Johnston & Mawson, 1953 Johnston & Mawson, 1953 Magadyptes antipoda Nueva Zelanda Eudyptula minor Australia ohnston & Mawson, 1942 Muraenesox cinereus Japón amaguti, 1935 Fregata magnificens Brasil chneider, 1866 Fregata magnificens Trinidad & Tobago e Hagedashia hagedash nilotica Zambia andground, 1933 C. haliaeti Haliaeetus leucogaster India aylis & Daubney, 1923 Pygoscelis papua Australia ohnston & Mawson, 1953 Johnston & Mawson, 1953 Eudyptes cristatus C. equulai G C. eudyptes C. eudyptulae J C. gracile Y C. granulosum S C. hagedashia S B C. heardi J Antártida Johnston & Mawson, 1953 Eudyptes chrysolophus Antártida Johnston & Mawson, 1953 Aptenodytes patagonica Antártida Phalacrocorax pelagicus Japón amaguti, 1941 Nagasawa, 1999 Phalacrocorax pelagicus Japón Barus et al., 2000 Phalacrocorax capillatus Japón Histiophorus orientalis Japón amaguti, 1935 Xiphias gladius Reino Unido olphi, 1819 C. macronectidis Macronectes giganteus Argentina chuurmans-Stekhoven, 1950 C. himeu Y C. histiophori Y C. incurvum Rud S Checklist del género Contracaecum (Anisakidae). 17 Taxonomía de Anisakidae C. magnipapilla Cha tum (=magnicollare) Anous minutus Hawai pin, 1925 Johnston & Mawson, 1941 Anous stolidus Australia Fagerholm et al., 1996 Anous melanogonys Islas Jaluit Johnston & Mawson, 1941 Diomedea sp. Australia Johnston & Mawson, 1941 Sula serrator Australia C. margolisi Zalophus californianus Canadá attiucci et al., 2003 C. marinum Lophius litulon Japón nnaeus, 1876 C. matwejewi Sterna macrura Rusia yman & Murdrezova, 1926 C. mexicanum Pelecanus occidentalis Méjico lores Barroeta, 1957 Ardeola ralloides Alemania olphi, 1809 Linstow, 1906 Ardeola grayii Sri Lanka Mönnig, 1923 Ardea cinerea Bélgica Layman & Andronova, 1926 Ardea purpurea Israel Yamaguti, 1941 Egretta garzetta Japón Hartwich, 1964 Casmerodius albus egretta Brasil Creplin, 1846 Nycticorax nycticorax Alemania Boero & Led, 1972 Nycticorax nycticorax nycticorax Argentina Yamaguti, 1941 Nycticorax nycticorax naevious Japón Yamaguti & Mitunaga, 1943 Nycticorax caledonicus Formosa, Argentina Caballero & Peregrina, 1938 Botaurus stellaris Méjico Hartwich, 1964 Butorides virescens EEUU Creplin, 1846 Phalacrocorax carbo Alemania Walton, 1923 Phalacrocorax africanus EEUU Vojtechovska Mayerova, 1952 Pelecanus onocrotalus Rep. Checa Hartwich, 1964 Pelecanus eryhrorhynchus Africa Caballero & Peregrina, 1938 Nycticorax nycticorax nycticorax Alemania Pelecanus sp. Yugoslavia tossich, 1890 Stossich, 1893 Pelecanus crispus Yugoslavia Hartwich, 1964 Pelecanus rufescens Congo Ezzat & Tadros, 1958 Pelecanus onocrotalus Congo Ybarra, 1948 Pelecanus eryhrorhynchus Méjico Kinsella et al., 2004 Pelecanus eryhrorhynchus EEUU Johnston & Mawson, 1941 Pelecanus conspicillatus Australia Ezzat & Tadros, 1958 Phalacrocorax africanus Congo Ezzat & Tadros, 1958 Butorides striatus Congo Chow, 1939 Nycticorax nycticorax nycticorax China Stossich, 1890 Falconidae Indochina M Li La F C. microcephalum Rud C. micropapillatum S Checklist del género Contracaecum (Anisakidae). 18 Taxonomía de Anisakidae C. milvi Y Milvus migrans Japón amaguti, 1935 Milvus lieatus Rusia arokhin, 1937 Mirounga leonina Antártida ikolskiy, 1974 Fagerholm, 1990 Mirounga leonina C. milviensis K C. mirounga N Antártida Fagerholm, 1990 Hidrurga leptonyx Australia Mattiucci et al., 2003 Mirounga leonina Argentina Presente estudio Spheniscus magellanicus Península Valdés, Chubut Mycteria americana Brasil von Drasche 1882 Lucker, 1941 Ardea herodias EEUU Navone et al., 2000 Ardea alba Argentina Vidal Martínez, 1994 Ardea alba Méjico Labriola & Suriano, 1996 Ardea alba Argentina Labriola & Suriano, 1996 Egretta thula Argentina Labriola & Suriano, 1996 Bobulcus ibis Argentina Kinsella et al., 2004 Pelecanus eryhrorhynchus EEUU Lucker, 1941 Anhinga anhinga EEUU Huizinga, 1967 Anhinga anhinga EEUU Deardoff & Oversteet, 1980 Mugil cephalus Golfo de Méjico Muraenesox cinereus China o & Fang, 1999 Colymbus nigricollis Rusia arokhin, 1949 C. multipapillatum C. muraenesoxi Lu C. nehli K Contracaecum n. sp.1 Phalacrocorax brasilianus Chile esente estudio Phalacrocorax brasilianus Península Valdés, Chubut Phalacrocorax brasilianus Bahia Blanca, Bs. As. Phalacrocorax magellanicus Punta Loma, Chubut Contracaecum Pr sp.2 Spheniscus magellanicus Costa Bonaerense esente estudio C. ogmorhini (=corderoi) Hydrurga leptonyx ohnston & Mawson, 1941 Mattiucci et al., 2003 Mirounga leonina Argentina Fagerholm & Gibson, 1987 Zalophus californianus Méjico Lent & Freitas, 1948 Arctocephalus australis Uruguay Fagerholm & Gibson, 1987 Arctocephalus tropicalis Sudáfrica Fagerholm & Gibson, 1987 Eumetopias jubatus EEUU Fagerholm, 1990 Arctocephalus spp. Finlandia Timi et al., 2003 Arctocephalus australis Argentina Pr J Checklist del género Contracaecum (Anisakidae). 19 Taxonomía de Anisakidae C. osculatum Phoca vitulina Rudolphi, 1802 Valter, 1979 Halichoerus grypus Finlandia Fagerholm, 1990 Phoca hispida Mar Báltico Kloser & Plotz, 1992 Erignathus barbatus Japón Mattiucci et al., 1998 Erignathus barbatus Japón Mattiucci et al., 1998 Theragra chalcogramma Japón Mattiucci et al., 2003 Mirounga leonina Argentina C. oshmarini Uria lomvia Rusia Mozgovoi, 1950 Uria aalge C. otolithii Otolithus argenteus India ees & Rashid, 1982Bilq C. ovale Podiceps cristatus Alemania nstow, 1907 Macko, 1961 Podiceps griseigena Rep. Checa Mozgovoi, 1953 Podiceps auritus Rusia Moz Li govoi, 1953 Podiceps ruficollis Rusia Vuylsteke, 1953 Podiceps ruficollis capensis Congo Macko, 1961 podiceps negricollis Rep. Checa Hartwich, 1964 Podilymbus podiceps Brasil Pagrosomus unicolor Japón amaguti, 1935 C. pagrosomi Y C. pandioni Pandion haliaetus Rusia obolev & Sudarikov, 1936 Thalassarche melanophris Australia ohston & Mawson, 1942 Lent & Freitas, 1948 Thalassarche melanophris S C. pelagicum J Uruguay Portes Santos, 1984 Spheniscus magellanicus Brasil Silva et al., 2005 Sula leucogaster Brasil Garbin et al., 2007 Spheniscus magellanicus Península Valdés, Chubut Garbin et al., 2007 Spheniscus magellanicus Mar del Plata, Bs As. Garbin et al., 2007 Thalassarche melanophris Península Valdés, Chubut Presente estudio Phalacrocorax albiventer Punta León, Chubut Nycticorax nycticorax naevious Uruguay nt & Freitas, 1948 Podiceps cristatus Australia ohnston & Mawson, 1949 C. plagiaticium Le C. podicipitis J Checklist del género Contracaecum (Anisakidae). 20 Taxonomía de Anisakidae C. punctatum Pseudotantalus ibis Congo Belga Gedoelst, 1916 C. pyripapillatum Pelecanus conspicillatus Australia hamsi et al., 2008 Anhinga anhinga EEUU cker, 1941 Leptonychotes weddelli Antártida nstow, 1907 Kloser & Plotz, 1992 Lepton S C. quincuspis Lu C. radiatum Li ychotes weddelli Antártida Fagerholm, 1990 Leptonychotes weddelli Antártida Baylis, 1936 hydrurga leptonys Antártida Baylis, 1936 Ommatophoca rossi Antártida Anhinga rufa Congo Belga edoelst, 1916 Schuurmans-Stekhoven, 1937 Bagrus sp. C. rodhaini G Argentina Schuurmans-Stekhoven, 1937 Clarias sp. Argentina Nycticorax sp. Africa, India nal, 1912 C. rudolphii Phalacrocorax carbo Alemania ch, 1964 Baer, 1959 Phalacrocorax carbo lugubri C. rosarium Con Hartwi s Alemania Yamaguti, 1941 Phalacrocorax carbo hanedae Congo Li et al., 2005 Phalacrocorax carbo sinensis Japón Abollo et al., 2001 Phalacrocorax aristotelis España Huizinga, 1966 Phalacrocorax aristotelis aristotelisAlemania Hartwich, 1964 Phalacrocorax auritus España Hartwich, 1964 Phalacrocorax capensis EEUU Torres et al., 2000 Phalacrocorax brasilianus Sudafrica Amato et al., 2006 Phalacrocorax brasilianus Brasil Linstow, 1888 Phalacrocorax penicillatus Uruguay Hartwich, 1964 Phalacrocorax verucosus Chile Hartwich, 1964 Mergus merganser Brasil Hartwich, 1964 Mergus serrator EEUU Hartwich, 1964 Bucephala clangula Islas Kerguelen Anhinga rufa Congo upta & Johri, 1989 Poliocephalus ruficollis capensis Congo Belga Vuylsteke, 1953 C. rufai G C. ruficolle Checklist del género Contracaecum (Anisakidae). 21 Taxonomía de Anisakidae C. scotti Diomedea melanophris Antártida Leiper & Atkinson, 1914 C. sindicum Phalacrocorax niger India kram, 1997 Siniperca sp. Rusia iel & Achmerov, 1946 C. sinulabiatum Phalacrocorax sp. Australia ohnston & Mawson, 1941 Johnston & Mawson, 1941 Plotus novae A C. sinipercae Dog J Australia C. septentrionale Phalacrocorax aristotelis Islandia eis, 1955 Nadler, 2000 Phalacrocorax carbo Islandia Abollo et al., 2001 Phalacrocorax aristotelis aristoteli Kr sEspaña Li et al., 2005 Alca torda España Spheniscus magellanicus Argentina oero & Led, 1970 C. squalii Squalius schmidtii Bulgaria nstow, 1908 Larus canus Japón Yamaguti, 1935 Phalacrocorax a. albiventer Argentina utierrez 1943 Lent & Freitas, 1948 Phalacrocorax brasilianus Uruguay Morgan et al., 1949 Pandion haliaetus carolinensis EEUU C. spheniscus B Li C. torquatum C. travassosi G C. trichiuri Leiognathus daura India hwaite, 1927T C. tricuspis Ardea sp. Congo Gedoelst, 1916 Barson & Marshall, 2004 Anhinga sp. Congo Barson & Marshall, 2004 Anhinga melanogaster Zimbabwe Plotus sp. Australia C. turgidum Monachus schauislandii Hawai pin, 1927 Fagerholm, 1990 Monachus schauislandii Hawai Phalacrocorax capillatus Japón Yamaguti, 1941 Mozgovoi, 1953 Phalacrocorax capillatus Cha C. umiu Checklist del género Contracaecum (Anisakidae). 22 Taxonomía de Anisakidae C. variegatum (=yamaguti) Gavia stellata Alemania Rudolphi, 1809 Hartwich, 1964 Gavia immer Alemania Hartwich, 1964 Alca torda Alemania Hartwich, 1964 Uria aalge Alemania Mozgovoi, 1950 Uria lomvia Rusia Yamaguti, 1935 Larus canus Japón Hartwich, 1964 Rissa tridactyla Alemania Hartwich, 1964 Anous melanogenys Alemania Chapin, 1927 Anous hawajiensis Hawai Johnston & Mawson, 1941 Anous stolidus Australia Mergus merganser Japón C. zenis Zeus capensis Reino Unido aylis, 1929 Baylis, 1929 Zenopsis nebulosa Japón amaguti, 1941 Peristedion orientale Japón B C. zenopsis Y Checklist del género Contracaecum (Anisakidae). 23 Taxonomía de Anisakidae Antecedentes de investigación en Anisakidae Si bien son escasos los reportes de anisákidos en aves marinas de Sudamérica, algunos estudios indican la presencia de adultos de Contracaecum spp. y Anisakis spp. En Chile y Brasil, Contracaecum rudolphiii (=C. spiculigerum) (Hartwich, 1964) fue observado en P. brasilianus (=olivaceous) (Torres et al., 1991, 1993; Fedynich et al., 1997; Vicente et al., 1997; Torres et al., 2000), en P. a. albiventer (Gutiérrez, 1943; Torres et al., 1992) de Brasil, y en Larus dominicanus, Larus maculipennis y Larus serranus (Tschudi) (Laridae) (Torres et al., 1983; 1993, 2000) de Chile. En Argentina, la mayoría de los trabajos sobre Anisakidae han sido referidos a ambientes lacustres o salobres. Kreiter & Semenas (1997) señalaron la presencia de juveniles de Contracaecum sp. en L. dominicanus de Bariloche (provincia de Río Negro) y Labriola & Suriano (1996) observaron la presencia de Contracaecum philomultipapillatum en Ardea alba Linnaeus (Ardeidae) de la provincia de Buenos Aires. Esta especie fue redescripta y sinonimizada como Contracaecum multipapillatum (von Drasche, 1882) a partir de ejemplares obtenidos en el mismo hospedador (Navone et al., 2000). Contracaecum microcephalum (Rudolphii, 1809) fue observado en la garza blanca Ardea (=Casmerodius) alba (Gmelin) (Ardeidae) en la provincia de Tucumán y Contracaecum longicaecum Schuurmans-Stekhoven, 1951 fue registrado en el pez de agua dulce Platystoma sp. (Pimelodidae) en el río Paraná, Santa Fe (Schuurmans-Stekhoven, 1951). Esta ultima especie fue denominada como “species inquirenda” por Navone et al. (2000) debido a que su descripción fue basada sólo en larvas. Los reportes de Anisakidae en aves marinas se restringen al hallazgo de Malacalza et al. (1998), quienes al estudiar la dieta del cormorán real P. a. albiventer en Punta León, Chubut, hallaron ejemplares de Contracaecum sp. en bolos regurgitados y sugirieron que éste hábito (regurgitación) contribuiría a disminuir la intensidad parasitaria y a controlar las infrapoblaciones. Boero et al. (1972) hallaron a Contracaecum microcephalum parasitando especies de Ardeidae, tales como Ardea cocoi Linnaeus y Nicticorax nicticorax (Gmelin). Contracaecum spheniscus Boero & Led, 1970 fue descrito sobre la base de un único ejemplar macho hallado en un pingüino de Magallanes del zoológico de La Plata, Buenos Aires (Boero & Led, 1970). En la costa patagónica, Contracaecum travassosi Gutiérrez, 1943 fue descrito parasitando a P. a. albiventer de la Península Valdés, Chubut (Gutiérrez, 1943); y Schuurmans-Stekhoven (1950) describió a Contracaecum macronectidis parasitando al petrel gigante, Macronectes giganteus. 24 Taxonomía de Anisakidae En mamíferos marinos, Timi et al. (2003) reportaron la ocurrencia de Contracaecum ogmorhini s. s. Johnston & Mawson, 1941 en Arctocephalus australis (Zimmermann) (Otariidae) de la costa bonaerense y discutieron el estatus taxonómico de esta especie y de Contracaecum corderoi Lent & Freitas, 1948, colectado en el mismo hospedador. Mattiucci et al. (2003) estudiaron el estatus taxonómico mediante el análisis genético molecular de C. ogmorhini parasitando a A. australis y Mirounga leonina Linnaeus (Phocidae) de la costa del Mar Argentino. Este último hospedador además albergó especímenes de Contracaecum osculatum Rudolphii, 1802 y Contracaecum mirounga Nikolskiy, 1974. Posteriormente, Mattiucci et al. (2008b) estudiaron las relaciones genéticas de C. ogmorhini, encontrado en A. australis de la costa argentina, y C. mirounga parasitando a Mirounga leonina de Península Valdés, con otras 9 especies del género Contracaecum de diferentes regiones del mundo. En peces, Cremonte & Sardella (1997) reportaron la presencia de larvas L3 de Contracaecum sp. en ejemplares de Scomber japonicus Houttuyn (Scombridae) provenientes de dos sitios costeros diferentes del Mar Argentino. Posteriormente Sardella et al. (1998) hallaron larvas L3 de Contracaecum sp. en Genypterus blacodes Schneider (Ophidiidae) provenientes de diversos sitios de la costa atlántica argentina. Timi et al. (2001) y Timi (2003) registraron larvas de tercer estadio (L3) de Contracaecum sp. parasitando a Engraulis anchoita Hubbs & Marini (Engraulidae) a lo largo de la plataforma del Mar Argentino. Sardella & Timi (2004) reportaron larvas L3 de Contracaecum sp. en Merluccius hubbsi Marini (Merluciidae) proveniente de la zona marítima pesquera común argentino-uruguaya. Posteriormente Timi et al. (2005) reportaron larvas (L3) de Contracaecum en Cynoscion guatucupa (Cuvier) proveniente de muestras de la costa atlántica sudamericana y recientemente, Braicovich & Timi (2008) reportaron que Percophis brasiliensis Quoy & Gaimard (Percophidae) es hospedador de las L3 de Contracaecum. Estadios larvales de Contracaecum spp. fueron reportados por Diaz (2006) en L. dominicanus de la costa atlántica. En varias especies de peces de agua dulce provenientes del río Paraná, Santa Fe, Moravec (1998) describió larvas L3 de Contracaecum sp. a las cuales denominó larvas “Tipo 2”. Si bien investigaciones recientes permitieron ampliar el conocimiento sistemático- biológico de nematodos Anisakidae en algunas especies de aves (Navone et al., 2000; Pazos et al., 2000; Cremonte et al., 2001; Diaz et al., 2001; Cremonte et al., 2002; Diaz & Pazos, 2004; Pazos et al., 2003), diferentes especies de aves deberían ser analizadas con el fin de 25 Taxonomía de Anisakidae conocer la fauna de nematodos que albergan. Sobre esta base se intentó responder a la siguiente pregunta: *¿Diferentes especies de aves marinas piscívoras están parasitadas por las mismas especies de anisákidos? Para lo cual se plantearon los siguientes objetivos - Caracterizar cuali y cuantitativamente los nematodos adultos Anisakidae, parásitos de aves marinas, presentes en S. magellanicus, P. a. albiventer, P. a. atriceps, P. brasilianus, P. magellanicus y T. melanophris. - Clarificar la composición taxonómica de los anisákidos adultos y estimar su diversidad describiendo o redescribiéndolos, mediante el uso de diferentes técnicas (microscopio óptico y electrónico de barrido; electroforesis de isoenzimas, genética molecular cualitativa). Materiales y Métodos Toma de muestras y procesamiento de los hospedadores Para la realización de los muestreos se contó con los permisos pertinentes, tanto de la Dirección de Fauna y Flora como de la Secretaría de Turismo y Áreas Protegidas de la Provincia de Chubut. Se realizaron diferentes campañas de investigación sobre las distintas especies de aves seleccionadas para este trabajo desde el año 2005 al 2008, aunque el número de muestras se incrementó aún más con el uso de ejemplares capturados con anterioridad, entre los años 1990 y 2003. Todas las aves fueron colectadas muertas, excepto aquellas moribundas a las cuales se les permitió morir naturalmente en el campo y luego fueron colectadas. Siempre que fuera posible, los hospedadores se trasladaron inmediatamente al laboratorio para realizar la prospección helmintológica en fresco y lograr una buena fijación de los nematodos y/o su observación en vivo. De lo contrario se realizó la disección en el campo y las vísceras se congelaron o bien se fijaron en formol 10% o se conservaron en alcohol 70%. La misma metodología se empleó para los pellets y regurgitados de los cormoranes. Para Spheniscus magellanicus se realizaron 5 campañas en la estancia San Lorenzo de Península Valdés, Chubut, de no más de tres días de duración cada una, desde la eclosión 26 Taxonomía de Anisakidae de los huevos (fines de noviembre) hasta su ingreso al mar (finales de marzo) durante los años 2005 a 2008. Se colectó un total de 106 individuos muertos correspondientes, en su mayoría pichones (n = 78), el resto fueron adultos y juveniles. Las fechas de campaña fueron elegidas de acuerdo al estado de desarrollo de las crías, de manera de indagar acerca del reclutamiento de larvas con la ingestión de sus presas, el estado de desarrollo de los nematodos en el estómago y su distribución a lo largo del tracto digestivo del hospedador. Además se trabajó sobre 25 pingüinos que habían sido colectados a intervalos irregulares desde el año 1990 al 2003 en sectores costeros de Península Valdés: estancia San Lorenzo, Playa Fracasso, Puerto Madryn, Punta Pardelas y Punta Norte; 4 adultos provenientes de Mar del Plata, 2 de Claromecó, 13 de Cabo Vírgenes, 11 de Tierra del Fuego y uno del Zoológico de La Plata. El total de pingüinos examinados fue de 161 ejemplares, 38 adultos, 14 juveniles y 109 pichones. -Phalacrocorax a. albiventer: se colectaron 14 individuos a intervalos irregulares desde el año 1994 al 2008 en diferentes sitios de Península Valdés y en Punta León, Chubut. El total de individuos fue de 9 adultos y 5 pichones. Además se realizaron 3 campañas de recolección de pellets al azar en la cormoranera de Punta León y también una recolección de regurgitados en el mismo sitio durante los períodos reproductivos de la especie desde el año 2005 al 2008. Se colectó un total de 140 pellets y 28 regurgitados. -Phalacrocorax a. atriceps: se colectaron 12 individuos a intervalos irregulares durante los años 1999 a 2006, 10 provenientes de Bahía Bustamante y 2 de Puerto Madryn. -Phalacrocorax brasilianus: se colectaron 3 individuos provenientes de diferentes sitios costeros de Playa Fracasso, Península Valdés, desde el año 2000 al presente. Complementariamente, se colectó 1 individuo de la Isla Norte, Bahía Blanca, Buenos Aires, y 4 de la Laguna Santa Elena, VIII Región, Chile. -Phalacrocorax magellanicus: sólo se colectaron 2 ejemplares provenientes de Punta Loma, Chubut (42º 49’ S, 64º 53’ O), en diciembre del 2000. Además se colectaron 30 pellets en una campaña realizada en enero del 2002 en el mismo sitio. Cabe aclarar que esta especie presenta una alta dificultad para ser muestreada debido a su hábito de nidificación en acantilados, lo cuál hace casi imposible su acceso. -Thalassarche melanophris: se colectaron 5 ejemplares en playas de Península Valdés y alrededores desde el año 2000 al presente. Dos ejemplares fueron obtenidos por medio de barcos pesqueros que los capturaron accidentalmente con sus redes. 27 Taxonomía de Anisakidae Prospección de los nematodos Las aves muertas, preferentemente en buena condición, fueron disecadas en el campo o en el laboratorio (Fig. 4). El tracto digestivo fue colocado en bolsas zip-loc y conservado en formol 10% o alcohol 100%, dependiendo si el destino final era realizar estudios de biología molecular o únicamente morfológicos. En el laboratorio las vísceras se examinaron bajo lupa estereoscópica y los nematodos recolectados fueron conservados en alcohol 70%. Se examinaron el esófago y el estómago preferentemente, aunque en algunas aves se realizó la prospección del aparato digestivo completo (Fig. 5). En pingüinos, el esófago se disecó en 5 secciones iguales y el estómago se prospectó como una única unidad. Para su diagnosis, los nematodos fueron transparentados con lactofenol y estudiados utilizando un microscopio óptico (Olympus BX51). Se hicieron dibujos con la ayuda de la cámara clara incorporada al microscopio. Adicionalmente, algunos especímenes fueron estudiados con la ayuda del microscopio electrónico de barrido (MEB, Marca LV), perteneciente al Museo de La Plata. Para el MEB, se les realizó punto crítico a los nematodos y posteriormente fueron metalizados con baño de osmio, se observaron a diferentes magnificaciones y se fotografiaron. Las medidas de los caracteres morfológicos están expresadas en milímetros (mm), para los adultos se expresa la media seguida por el rango entre paréntesis. Para las larvas se expresa la media seguida por el desvío estándar y el rango entre paréntesis. Se realizaron análisis estadísticos de ANOVA a 1 factor para comparar medias de los carateres morfológicos (e.g. adultos de C. pelagicum provenientes de S. magellanicus y T. melanophris de Península Valdés) (P < 0.05). En otros casos se realizaron además pruebas de t-Estudent. Para la determinación e identificación de las especies de Anisakidae se utilizaron manuscritos con las descripciones originales y algunas claves (e.g. Hartwich, 1974; Fagerholm, 1990). 28 Taxonomía de Anisakidae Figura 4. Trabajo de campo. a, c) Recolección de aves muertas; b, d, e, f) Disección de las aves; e) almacenaje de vísceras en bolsas zip-loc. 29 Taxonomía de Anisakidae Figura 5. Trabajo de Laboratorio: a) Prospección de un estómago de pingüino infestado con anisákidos bajo lupa estereoscópica; b) prospección de un esófago de pingüino infestado con anisákidos; c) nematodos anisákidos en una cáspula de Petri; d) prospección de un pellet de cormorán real, e-f) visualización de anisákidos bajo microscopio óptico. 30 Taxonomía de Anisakidae Resultados Se describieron 3 nuevas especies del género Contracaecum y se redescribió a Contracaecum pelagicum Johnston & Mawson, 1942, la cual fue encontrada parasitando el tracto digestivo de S. magellanicus, T. melanophris y P. a. albiventer provenientes de Península Valdés, Chubut. Los individuos pertenecientes a la primera especie descrita, Contracaecum chubutensis Garbin, Diaz, Navone & Cremonte, 2008, fueron colectadados del proventrículo de Phalacrocorax a. atriceps proveniente de Bahía Bustamante y Puerto Madryn, Chubut. La segunda especie descrita fue Contracaecum n. sp.1, la cual parasita a ejemplares de P. brasilianus provenientes de tres sitios diferentes: laguna Santa Elena, VIII Región, Chile; Playa Fracasso, Península Valdés, Chubut; Bahía Blanca, Buenos Aires; y Phalacrocorax magellanicus proveniente de Punta Loma, Chubut. La tercera especie descrita fue Contracaecum bioccai Mattiucci, Paoletti, Olivero-Verbel, Baldiris, Arroyo- Salgado, Garbin, Navone, Nascetti, 2008, la cual parasita al pelícano marrón Pelecanus occidentalis Linnaeus (Pelecanidae) del pantano Totumo, Colombia, que si bien no forma parte de los objetivos de este trabajo, contribuye a comprender la caracterización específica de las especies de Contracaecum mediante estudios de genética molecular (Mattiucci et al., 2008). Asimismo se describen otras dos especies que parasitan al pingüino de Magallanes, Contracaecum mirounga y Contracaecum sp.2. La primera fue hallada en un ejemplar de S. magellanicus de Península Valdés, la segunda pertenecería a una nueva especie y fue encontrada en un único ejemplar de S. magellanicus del Zoológico de La Plata, cuyo origen sería algún sitio de la costa bonaerense. Se presentan datos morfométricos y fotos al MEB para cada una de las especies descriptas, excepto para C. bioccai. Paralelamente se brindan, para todas las especies, dibujos realizados con la ayuda de una cámara clara. Para C. pelagicum, Contracaecum n. sp.1 y C. bioccai, se aporta además una exhaustiva caracterización genético-molecular comparándolas con otras especies del género Contracaecum analizadas con la misma metodología (ver Capítulo 2). 31 Taxonomía de Anisakidae Contracaecum pelagicum Johnston & Mawson, 1942 *Redescripción Adulto (20 especímenes provenientes de S. magellanicus de Península Valdés, Tablas 1 y 2, Figs. 6, 7, 8 y 9): Cutícula completamente estriada transversalmente (Figs. 7b, e). Collar cefálico conspicuo, con los bordes libres concéntricos profundos y con una región lateral estrecha en forma de “V” sin estriaciones (Figs. 7a, c). Tres interlabios bifurcados (Figs. 7a, c, d), labios más altos que los interlabios con 3 muescas o hendiduras apicales, la central más profunda y amplia que las laterales (Figs. 7a, c). Presentan 2 aurículas, cada una con procesos puntiagudos dirigidos lateralmente hacia las esquinas anteriores, ambos con 2 extremos sensoriales (tips) (Figs. 7a, c, d); papilas grandes dobles, 2 sobre el labio dorsal y 1 en cada labio ventrolateral (Figs. 7a, c). Anfidos redondeados localizados en los labios ventrolaterales (Fig. 7a). Deiridos inconspicuos y de forma redondeada (Figs. 6, 7b, ver flechas). Ventrículo con el apéndice posterior sólido, ciego intestinal bien desarrollado, más largo que el apéndice ventricular (Fig. 6). Macho (10 especímenes provenientes de S. magellanicus de Península Valdés): Longitud del cuerpo 17,56 (11,00–25,08). Ancho máximo del cuerpo 0,67 (0,56-0,96). Distancia del extremo anterior al anillo nervioso 0,46 (0,36–0,51) y a los deiridos 0,65 (0,57–0,73). Longitud del esófago 2,78 (1,90–3,97); longitud del ciego intestinal 1,97 (1,56–2,68); longitud del ventrículo 0,22 (0,16–0,26); longitud del apéndice ventricular 0,74 (0,63–0,83). Espículas de igual longitud 4,10 (3,07–5,07). Distancia de la cloaca al extremo posterior 0,18 (0,11–0,29). Extremo caudal cónico presentando 25–31 pares de papilas precloacales, los primeros 18 pares proximales son bien notorios. Pts-zone abarca 3 pares de papilas precloacales (Fig. 7e). Siete pares de papilas postcloacales: 2 pares subventrales paracloacales grandes situadas lado a lado, 2 pares subventrales, 2 pares sublaterales y 1 par de fásmidos cercano al par de papilas sublaterales distales (Fig. 7e). Extremo distal de la espícula extenso y puntiagudo; longitud del mismo mayor al ancho de la espícula (0,063 vs. 0,020) (Figs. 7f, g). Valvas de la espícula insertadas en puntos diferentes (Fig. 7f, flecha). 32 Taxonomía de Anisakidae Hembra (10 especímenes provenientes de S. magellanicus de Península Valdés): Longitud del cuerpo 24,17 (17,56–33,05). Ancho máximo del cuerpo 0,94 (0,52-1,48). Distancia del extremo anterior al anillo nervioso 0,55 (0,48–0,65) y a los deiridos 0,72 (0,62–0,90). Longitud del esófago 3,03 (2,81–3,32); longitud del ciego intestinal 2,38 (2,10–2,74); longitud del ventrículo 0,22 (0,17–0,26); longitud del apéndice ventricular 0,72 (0,65–0,82). Vulva en la mitad anterior del cuerpo, distancia al extremo anterior 6,94 (5,28–9,23). Diámetro de huevos embrionados 0,06 (0,057–0,064). Distancia del ano al extremo posterior 0,41 (0,30–0,63). Resumen taxonómico Hospedadores: Spheniscus magellanicus Forster (Spheniscidae), Thalassarche melanophris Temminck (Diomedeidae) y Phalacrocorax a. albiventer Lesson (Phalacrocoracidae). Localidades: Península Valdés, Chubut (42º04’ – 42º53’ S, 63º38’- 64º30’ O), Mar del Plata, Buenos Aires (38º05’ S, 57º38’ O), Cabo Vírgenes, Santa Cruz (52°16' - 52°55' S, 68°02' - 69°22' O), y Punta León, Chubut (43º04’ S, 64º29’ O). Sitio de infección: estómago. Prevalencia: 40% para S. magellanicus de Península Valdés (n=20), 100% para S. magellanicus de Mar del Plata (n=4) y 100% para T. melanophris de Península Valdés (n=3). Intensidad media: 149 para S. magellanicus de Península Valdés. Depósito de los especímenes: Colección Helmintológica del Museo de La Plata (5591 CHMLP), Buenos Aires. Paratipos: 10 hembras y 20 machos. Comentarios De las especies de Contracaecum encontradas en mamíferos marinos, Contracaecum ogmorhini y Contracaecum margolisi Mattiucci et al., 2003 son muy similares a C. pelagicum en cuanto a la distribución espacial de las papilas caudales, sin embargo ellos no exhiben interlabios bífidos y sus espículas son más largas (Mattiucci et al., 2003; Timi et al., 2003). Contracaecum osculatum, C. mirounga y Contracaecum radiatum (Linstow, 1907), poseen interlabios no bifurcados, papilas paracloacales dobles y 2 filas de papilas precloacales de cada lado (Baylis, 1936; Fagerholm, 1988; Fagerholm et al., 1996). De las especies de Contracaecum que parasitan aves marinas, C. magnipapillatum (=C. magnicollare) Johnston & Mawson, 1941, que parasita a Anous minutus Chapin (Laridae) 33 Taxonomía de Anisakidae y Contracaecum septentrionale Kreis, 1955, parásita de Phalacrocorax aristotelis (Linnaeus), comparten casi todos los rasgos morfológicos, como el patrón de distribución espacial de las papilas caudales, pero carecen de interlabios bifurcados (Johnston & Mawson, 1941; Kreis, 1955; Hartwich, 1964; Fagerholm et al., 1996). En contraste, C. multipapillatum (von Drasche, 1882) procedente de Ardea alba (Ardeidae), Contracaecum heardi Mawson, 1953 de Pygoscelis papua Forster (Spheniscidae) y Contracaecum eudyptes Johnston & Mawson, 1953 de Eudyptes sp. (Spheniscidae) pueden distinguirse de C. pelagicum por tener interlabios no bifurcados, un par de papilas paracloacales dobles y 2 filas de papilas precloacales proximales de cada lado cerca de la cloaca (Mawson, 1953; Portes-Santos, 1984; Navone et al., 2000). Contracaecum spheniscus Boero & Led, 1970 que también posee interlabios no bifurcados, tiene un número menor de papilas pre- y postcloacales y un apéndice ventricular más corto que el de C. pelagicum (Boero & Led, 1970). Contracaecum travassosi Gutiérrez, 1943 de Phalacrocorax a. albiventer, C. rudolphiii de Phalacrocorax carbo Linnaeus (Phalacrocoracidae), Contracaecum eudyptulae Johnston y Mawson, 1944, de Eudyptula minor (Forster) (Spheniscidae) y Contracaecum variegatum Rudolphii, 1809 de Colymbus septentrionalis (=Gavia stellata) (Pontoppidan) (Gaviidae), poseen interlabios bifurcados y son muy similares a C. pelagicum (Gutiérrez, 1943; Johnston & Mawson, 1944; Hartwich, 1964; Fagerholm et al., 1996). Sin embargo, el macho de C. travassosi posee interlabios tan altos como los labios, más anchos en la base con el surco menos notorio y espículas más largas (7,7–11,1 vs. 3,07–5,07 mm) y, por consiguiente, una relación menor: longitud del cuerpo / longitud de espícula (2,1–2,3 vs. 3,4–5,1 mm). La cola de C. travassosi es más roma y constreñida notoriamente a nivel de las papilas subventrales y sublaterales (Gutiérrez, 1943). Contracaecum rudolphiii tiene las espículas más largas (4,1–10,0 vs. 3,07-5,07 mm) y una relación menor cuerpo / longitud de espícula (2,7–3,4 vs. 3,4–5,1), las espículas más romas y las papilas paracloacales más pequeñas con disposición oblicua. Además, la cola de C. rudolphiii también es más roma con una marcada constricción distal (Hartwich, 1964; Barus et al., 2000; Abollo et al., 2001). Contracaecum eudyptulae tiene una cola más roma, las papilas paracloacales con una disposición oblicua, menos pares de papilas precloacales y una relación menor cuerpo / longitud de espícula (1,70–2,80 vs. 3,41–5,10) (Johnston & Mawson, 1944). Contracaecum variegatum posee las extensiones de las aurículas labiales en forma de gancho, el interlabio es menos robusto con un surco más marcado y el número de pares de papilas precloacales es mayor (29–46 vs. 25–31). Además, C. variegatum tiene una relación mayor: longitud del 34 Taxonomía de Anisakidae cuerpo / ancho del cuerpo (29,1-55,0 vs. 17,7–30,5 en los machos; 34,0–98,7 vs. 19,0–33,8 en las hembras) (Hartwich, 1964; Fagerholm et al., 1996). Las pruebas de ANOVA corroboraron que no hubieron diferencias significativas (P > 0,05) entre los caracteres morfológicos de los especímenes provenientes de S. magellanicus y T. melanophris de Península Valdés. 35 Taxonomía de Anisakidae 36 Re fe re nc ia Jo hn st on & M aw so n (1 94 2) Le nt & F re ita s (1 94 8) Po rt